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關(guān)于生物固氮原理應(yīng)用及研究進展
摘要：生物固氮是自然生態(tài)系統(tǒng)中氮的主要來源全球生物固氮的量是巨大的，海洋生態(tài)系統(tǒng)每年生物固氮量在四百萬噸到兩千萬噸，陸地生態(tài)系統(tǒng)生物固氮量在九百萬噸到一千三百萬噸，而工業(yè)固氮量在世紀(jì)年代中期每年約為一千三百萬噸�？梢�，生物固氮在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和氮素生態(tài)系統(tǒng)平衡中的作用很大我國農(nóng)民利用豆科植物固氮肥田歷史悠長，直至現(xiàn)在仍保留著豆科植物和非豆科植物輪作套作和間作等耕作制度國外也十分重視固氮生物在農(nóng)業(yè)中的作用。
關(guān)鍵詞：生物固氮；聯(lián)合固氮菌；自生固氮菌
一、生物固氮的原理
1982年，Postage以肺炎克氏菌為例提出一個固氮酶催化機理模式，至今仍被廣泛采用其總反應(yīng)式為：N2+6H++nMg-ATP+6e-(酶)→2NH3+nMg-ADP+nPi固氮微生物的固氮過程是在細(xì)胞內(nèi)固氮酶的催化作用下進行的不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情況基本相同在固氮酶將還原成的過程中，需要e和H+，還需要ATP提供能量生物固氮的過程十分復(fù)雜[1]，簡單地說，即在ATP提供能量的情況下，e和H+通過固氮酶傳遞給N2，使它們還原成NH3，而乙炔和N2具有類似的接受e還原成乙烯的能力。
二、固氮微生物的種類
固氮微生物多種多樣，不同的劃分標(biāo)準(zhǔn)滿足了不同的要求。從它們的生物固氮形式來分，有自生固氮、聯(lián)合固氮、和共生固氮3種。
①自生固氮微生物是指能夠在自由生活狀態(tài)下固氮的微生物總稱。在自然界，自生固氮微生物種類很多，分散地分布在細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌的不同科、屬和不同的生理群中；并大致可以分為光合細(xì)菌和非光合細(xì)菌兩類。前者如紅螺菌、紅硫細(xì)菌和綠硫細(xì)菌等，其中的某些種類可與其它微生物聯(lián)合而相互有利；后者的種類很多。根據(jù)非光合細(xì)菌的自生固氮菌對氧的需求，可以分為厭氧的細(xì)菌如梭狀芽胞桿菌[2]；需氧細(xì)菌如自生固氮菌、貝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼性細(xì)菌如多粘芽胞桿菌、克魯伯氏桿菌、腸桿菌等。自生固氮微生物中的某些種類，在有些情況下可以與植物進行聯(lián)合固氮。
一般地，自生固氮微生物固定的氮素滿足本身生長繁殖需要以后就不再固氮了，多余的氮反過來會抑制它們自身的固氮系統(tǒng)。同時，它們固氮效率也比較低。
據(jù)測定，每消耗1克碳水化合物，自生固氮微生物固定10毫克氮，而共生固氮的根瘤菌則可以固定270毫克氮。所以，這個類群的微生物從固氮量的角度衡量，對作物的氮素供應(yīng)的貢獻(xiàn)并非很大。許多試驗結(jié)果證明，這類微生物所產(chǎn)生的各種激素和其它活性物質(zhì)是促進作物生長的主要因素之一。
②聯(lián)合固氮微生物有些自生固氮微生物在特定植物根際環(huán)境中生長、繁殖比非根際土壤中旺盛得多，這是由于植物根系的分泌物和脫落物提供能源物質(zhì)，固氮微生物利用這些能源物質(zhì)生活和固氮，這種互利關(guān)系稱之為聯(lián)合固氮。聯(lián)合固氮體系最先是在雀稗和雀稗固氮菌之間發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)小麥、水稻和C4作物如甘蔗、玉米、高粱等禾本科植物亦存在聯(lián)合固氮體系。能夠進行聯(lián)合固氮的微生物種類較多，似乎沒有什么特異性[2,3]，有些微生物既可以在自生條件下進行自生固氮作用，又能在田間與一些禾本科作物進行聯(lián)合固氮作用。已經(jīng)報道過的聯(lián)合固氮的主要微生物種類有：浸麻芽胞桿菌、多粘芽胞桿菌、巴西固氮螺菌、含脂固氮螺菌、克魯伯氏桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌等。與共生固氮相比，聯(lián)合固氮微生物與植物之間的關(guān)系不緊密，雙方也沒有共同的組織結(jié)構(gòu)，因而固氮效率也不可能高。目前，對于聯(lián)合固氮體系的固氮量很難有一個比較準(zhǔn)確的估計，一般認(rèn)為每畝地每年約為0.5～1斤純氮。
③共生固氮微生物是指能與宿主植物形成特定固氮組織結(jié)構(gòu)的一類微生物。它們彼此生活在一起，植物向微生物提供光合產(chǎn)物供微生物固氮需要，微生物則向植物提供氮素營養(yǎng)，雙方互相有利。以豆科植物--根瘤菌共生體系來說，由于有根瘤組織作為它們的共生結(jié)構(gòu)，共生效率是最高的。其原因是這種共生體系滿足了上述所說的生物固氮的條件。已知的比較清楚的共生體系除了豆科植物--根瘤菌共生體系外，還有非豆科植物--固氮放線菌體系和紅萍--固氮藍(lán)藻共生體系。與相應(yīng)的豆科植物共生固氮的根瘤菌很多，迄今從豆科植物根瘤中分離出來并進行過研究的約有100多種，在生產(chǎn)上應(yīng)用的種類不足1/5。在分類上確定了分類地位的現(xiàn)在有5個屬，它們分別是：根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、固氮根瘤菌屬和中慢生根瘤菌屬。每個根瘤菌屬包括至少1個種。和上述的自生固氮和聯(lián)合固氮比較，共生固氮效率高，固氮量多，對于人類的意義和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的作用也最大[4]。迄今研究最為清楚、應(yīng)用最多的是豆科植物根瘤菌共生固氮體系，據(jù)測定，一般每年每畝固定純氮約為13.3公斤，約折合每畝地每年固定標(biāo)準(zhǔn)化肥130斤，且?guī)缀跞勘焕谩?/p>
三、當(dāng)前生物固氮的主要研究方法有哪些
在固氮生物研究中，最經(jīng)典的測定技術(shù)是凱氏定氮法其后，由于同位素示蹤法的出現(xiàn)，采用了15N示蹤法測定固氮量，比凱氏法的靈敏度提高1000倍。1966年以來，應(yīng)用乙炔還原法測定固氮酶活性是生物固氮研究中的一大突破，這一革新把生物固氮研究推向了一個新的階段其靈敏度比15N示蹤法還要高1000倍，而且方法簡單速度快，適于生物固氮方面研究，氮累計法該方法在生物固氮早期研究中成功運用過，但準(zhǔn)確率較低。
示蹤法：在固氮研究中，目前15N穩(wěn)定性同位素被認(rèn)為是最有效而實用的工具。15N示蹤法的靈敏度比常規(guī)凱氏定氮法高1000倍，且不需校正因子但其缺點是：（1）15N的價格較昂貴，需用較為復(fù)雜的質(zhì)譜儀測定；（2）測定的手續(xù)較繁瑣，不易準(zhǔn)確定量；（3）其靈敏度較乙炔還原法低1000倍。該方法是用塑料袋先將植物封住，抽出里面的空氣，導(dǎo)入高豐度的15N，經(jīng)過一段時間后取出樣本，用凱氏定氮法消化蒸餾，用Hg2+或CUSO4作催化劑，把15N轉(zhuǎn)化為15NH4，在高真空中用次溴酸鹽將15NH4轉(zhuǎn)化為15N2，直接導(dǎo)入質(zhì)譜儀中進行分析[5]。
同位素稀釋法：同位素稀釋質(zhì)譜法是通過同位素豐度的精確質(zhì)譜測量和所加入稀釋劑的準(zhǔn)確稱量，求得待測樣品中某元素的絕對量，有效地把元素的化學(xué)分析轉(zhuǎn)變?yōu)橥凰販y量，因此具有同位素質(zhì)譜測量的高精度和化學(xué)計量的高準(zhǔn)確度但其缺點非常明顯：（1）需要濃縮同位素，成本高；（2）樣品制備復(fù)雜，花費時間長，易受污染乙炔還原法1966年，RSchoollhorn和RHBurris以及澳大利亞Murdoch大學(xué)的MJDilworth發(fā)現(xiàn)固氮酶可以使乙炔還原為另一種氣體---乙烯年等用這種方法對自生固氮菌固氮酶提取液大豆根瘤等做了測定也對大豆根瘤進行了測定1968年，乙炔還原法測定活性已成為國際上固氮研究中最重要的測定技術(shù)乙炔還原法靈敏度高，比示蹤法高1000倍，而且方法簡單速度快除此之外，它還可進行生物固氮各方面的研究如自生固氮菌細(xì)胞或酶的提取液豆科或非豆科根瘤藻類禾本科植物根際聯(lián)合固氮等等它可以離體測定，也可以整株活體連續(xù)測定或原位測定該方法是將待測材料置于容器中，注滿乙炔，反應(yīng)一定時間后，用氣相色譜儀測定乙烯的生成量，以單位時間內(nèi)一定量樣品所產(chǎn)生的乙烯量來表示固氮酶活性此法速度快，靈敏度高這一方法的建立使生物氮研究方法取得了重
要突破[6,7,8]。
15N自然豐度法：自確定用大氣中15N豐度作為的標(biāo)準(zhǔn)自然豐度以來，利用
15固氮植物和非固氮植物利用有效氮源的不同而形成的植物N豐度的差異來測
定生物固氮量，已逐漸成為一種應(yīng)用范圍較廣的定量研究生物固氮手段，即自然豐度法這是目前國際上日益受到重視的一種方法，精度和同位素稀釋法接近，但成本便宜。
四、聯(lián)合固氮菌目前的研究進展及未來研究方向
聯(lián)合固氮菌是固氮生物中重要的類群，在為植物特別是糧食作物提供氮素、降低化肥用量、減少環(huán)境污染、維持生態(tài)平衡和促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用，并因此成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。由于聯(lián)合固氮細(xì)菌與植物之間是一種松散的結(jié)合，未能形成穩(wěn)定的共生結(jié)構(gòu)，因而受根際土壤因素的影響較大，這也給聯(lián)合固氮菌的研究帶來一些困難。目前聯(lián)合固氮作用研究主要有以下方面:①聯(lián)合固氮菌的鑒定及其在植物根部的定位觀察。②對聯(lián)合固氮體系建立過程中的形成機理和根際微生態(tài)系統(tǒng)中植物、土壤和細(xì)菌三者間的作用機理的闡明。③由于結(jié)合態(tài)氮是抑制固定大氣氮的主要因素，如何獲得能高效固氮的耐銨型菌株是亟待解決的問題之一[9]。④聯(lián)合固氮菌之間的相互關(guān)系及協(xié)同作用。⑤將聯(lián)合固氮菌引入禾本科植物根內(nèi)，誘導(dǎo)植物形成固氮根瘤。⑥固氮能源的供給及組成。雖然聯(lián)合固氮的固氮效應(yīng)不及共生固氮高，但其分布廣，受益作物多，因此對于非豆科植物而言[11,12]，聯(lián)合固氮可能成為將來農(nóng)、林、牧業(yè)中潛在的穩(wěn)定氮源，其生態(tài)意義和經(jīng)濟效益都是不可低估的。
五、自生固氮菌目前的研究進展及未來研究方向
有些高等植物與菌根真菌共生形成菌根，非豆科固氮植物固氮能力強，是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的供氮系統(tǒng)，植物內(nèi)生菌與寄主植物在長期的共同進化過程中形成共生關(guān)系[13]。它們通過固氮作用，產(chǎn)生生理活性物質(zhì)促進宿主對環(huán)境的適應(yīng)，在農(nóng)業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力。近年來，在甘蔗、玉米中發(fā)現(xiàn)了多種具有固氮功能的內(nèi)生細(xì)菌，引起了學(xué)術(shù)界的高度關(guān)注。
這一發(fā)現(xiàn)不僅對生物固氮調(diào)控有重要意義，也是對基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究中的一項重要貢獻(xiàn)。它為進一步研究光合和固氮之間的聯(lián)系，提供了理論基礎(chǔ)。
如果固氮微生物體內(nèi)具有氫酶，可以吸收氫產(chǎn)生的能量。這樣，就能提高其
固氮效率而增加產(chǎn)量。
目前，利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)移固氮基因從而使植物表達(dá)固氮作用已成為一項世界性的戰(zhàn)略課題。許多國家的科學(xué)家都在運用現(xiàn)代生物技術(shù)從事固氮菌的固氮機理和轉(zhuǎn)移微生物固氮能力等各方面的研究，展現(xiàn)固氮菌生物固氮的前景。針對目前固氮菌研究中存在的問題，目前關(guān)于固氮菌的發(fā)展主要集中在以下幾個方面
[14]：
1、改進現(xiàn)有固氮微生物的固氮效率
改變固氮酶作用中的放氫耗能反應(yīng)。由于固氮作用要消耗一定的能量，即消耗了植物光合作用的產(chǎn)物。因此可以設(shè)想，應(yīng)用基因工程手段，組建菌株，使釋放的能量再用于固氮酶的固氮作用[8]。培養(yǎng)菌株，解除抑制固氮酶合成，使固氮菌環(huán)境中能結(jié)瘤固氮。
2、利用生物工程技術(shù)，構(gòu)建新的固氮微生物
原核生物間的遺傳性能轉(zhuǎn)移是比較容易的。應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移培育高效固氮的根際細(xì)菌群，開辟根際細(xì)菌轉(zhuǎn)人固氮質(zhì)粒的研究[15,16]。
3、建立新的共生固氮體系
共生固氮體系是生物界中最有效的固氮組合。固氮作用所需要的能量來自宿主植物的光合作用。固氮產(chǎn)物直接為宿主的氮素營養(yǎng)，共生的兩方面相互有利，相互支持。但是，對農(nóng)、林和牧業(yè)生產(chǎn)有價值的共生固氮體系，在自然界中僅限于少數(shù)微生物與有限的豆科植物共生。研究擴大根瘤菌的共生范圍，使能在其它植物上結(jié)瘤固氮。或?qū)⒐痰驅(qū)敫叩戎参锛?xì)胞，創(chuàng)建能固氮的高等植物，自給氮素營養(yǎng)的植物類型是非常有意義的。
4、加強固氮菌遺傳工程的研究
從目前的研究現(xiàn)狀來看，試圖通過基因工程將固氮基因(nif)從豆科植物轉(zhuǎn)移到非豆科農(nóng)作物中難度比較大，在短期內(nèi)很難實現(xiàn)，而采用細(xì)胞工程方法將根瘤菌導(dǎo)入非宿主農(nóng)作物細(xì)胞內(nèi)則切實可行[17,18,19]。
5、建立新的共生固氮體系
由于Frankia菌具有對宿主的侵染范圍寬、固氮活性比較強和對氨氣不敏感等特性，在生物固氮研究中對Frankia茵的研究將更為重要，有可能由此會找到新的突破口。在Frankia菌與農(nóng)作物之間建立起新的共生固氮體系將具有更大的的可能性。
隨著生物科學(xué)的快速發(fā)展和對環(huán)境保護的日益重視，固氮菌必將引起更多的關(guān)注與研究，固氮微生物在農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護、工業(yè)生產(chǎn)等方面的應(yīng)用將更加深入的展開，人類也將從中獲益匪淺。
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