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    1. 分子生物學(xué)實驗講義示例

      時間:2022-06-29 18:01:57 生物/化工/環(huán)保/能源 我要投稿
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      分子生物學(xué)實驗講義示例

        CTAB法提取植物基因組DNA

      分子生物學(xué)實驗講義示例

        【實驗背景】

        高等動物,高等植物的基因組相當(dāng)龐大,一些物種的特定基因組包括了該物種生長,發(fā)育,繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量,因而對真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu),組成,以及表達(dá)調(diào)控的研究是至關(guān)重要的,而提取要求是獲得純度高和收得率高。

        【實驗?zāi)康摹?/strong>

        1、掌握植物材料基因組DNA的CTAB法提取分離基本原理的方法;

        2、掌握微量移液槍、液氮研磨、微量試管、高速離心機等使用操作技術(shù)。

        【實驗原理】

        植物組織采用液氮研磨達(dá)到細(xì)胞破碎,細(xì)胞內(nèi)容物采用CTAB分離蛋白質(zhì)、多糖,再有苯酚、氯仿、異戊醇混合液萃取純化,RNA由RNA酶消化,分離出的DNA由無水乙醇沉淀分離

        【材料儀器】

        材料:幼嫩的植物材料1.0g左右(紅葉石楠)

        儀器:移液槍、電子天平、恒溫水浴箱、高速離心機、EP管、液氮、研磨等。

        【實驗試劑】

        抽提緩沖液(2×CTAB溶液):2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、20mmol/LEDTA、1.4mol/L NaCL、1%β-巰基乙醇、

        0.1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、100mmol/L Tris-HCl(pH=8.0) TE: 10Mm Tris-HCl(pH=8.0),1mM EDTA

        其他試劑:液氮、RNA酶、氯仿、異戊醇、CTAB、無水乙醇、苯酚、EDTA等

        【實驗操作】

        取1.0g植物材料,雙蒸水洗凈,并用濾紙吸干 植物材料剪成0.5cm左右碎片,放入預(yù)冷的瓷研磨中。 加入液氮速冷,研磨成細(xì)粉(越細(xì)越好)。

        轉(zhuǎn)入加有抽提緩沖液3.0ml的5ml離心管

        60℃水浴保溫1小時(不時轉(zhuǎn)動試管)

        分裝成2個2.mlEP管,15,000 rpm,離心10分鐘

        取上清轉(zhuǎn)入另一個新的離心管,加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),混合均勻抽提至水乳膠融狀。

        15,000 rpm離心5分鐘

        上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中,加入0.8-1.0倍體積預(yù)冷異戊醇 ,-20℃保溫30分鐘-1小時,緩緩混勻DNA成絮狀折出

        15,000 rpm,離心5分鐘,棄上清

        DNA沉淀用冰冷的70%乙醇洗2次

        揮發(fā)盡乙醇后,用200μl TE緩沖液溶解DNA,-20℃凍存。

        【注意事項】

        1、使用新鮮、幼嫩的材料,材料應(yīng)適量。

        2、如果樣品容易呈粘稠狀,可能含有較多的多糖。

        3、如果樣品溶液呈棕色,可能含有較多的酚類物質(zhì)。

        4、操作過程中避免劇烈振蕩,器件、器皿和試劑需要高溫滅菌。

        【思考題】

        1、為什么要用新鮮、幼嫩的植物組織材料?

        2、為什么在操作過程中避免劇烈振蕩?

        3、為什么器件、器皿和試劑需要高溫滅菌?

        4、如何提高提取植物組織DNA的產(chǎn)量?

        苯酚:作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。

        氯仿:也可使蛋白質(zhì)變性并加速有機相與液相分層。

        異戊醇:有助于消除抽提過程中產(chǎn)生的氣泡。

        CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來

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